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葡萄糖是自然界分布最广且最为重要的一种单糖, 在生物医学领域和人体的生命健康方面有着重要的地位. 人体血液中葡萄糖的含量过大就会导致人患糖尿病[1], 当今时代随着人们生活水平的提高, 越来越多的人遭受到糖尿病所带来的困扰, 葡萄糖的检测在预防糖尿病方面有着至关重要的作用[2]. 除医学方面, 葡萄糖的检测在食品工业、生物技术等领域受到了研究人员的广泛关注[3-4].
在过去几十年的研究中, 已经开发许多技术用于检测葡萄糖, 包括电极法、比色法、高效液相色谱、分光光度法、化学发光、电化学传感器和光学传感等[5]. 与电化学传感器相比, 光纤传感器具有灵敏度高, 响应速度快, 抗电磁干扰, 长距离传感等优点[6-7]. 目前已报道的光纤葡萄糖传感结构有微纳锥形光纤[8]、长周期光纤光栅[9-10]、过度倾斜光栅[11]、表面等离子体共振结构[12]等. 相比于其他类型的光纤传感器, 光纤表面等离子体共振(Surface Plasmon Resonance, SPR) 生物传感器, 具有体积小、易于封装、灵敏度高等优点[13-15]. 而且在多参数的测量方面也有很大的应用前景[16-17].
本文提出一种反射式光纤SPR传感器, 通过疏基乙胺(MEA)在金膜进行氨基化处理, 然后通过光纤金膜表面游离的氨基与葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD)的羧基共价结合来固定葡萄糖敏感膜, 从而实现对葡萄糖浓度的测量, 灵敏度可达85.4 nm/(mg/mL), 与利用凝胶包覆法固定GOD设计葡萄糖传感器[11]相比, 本文提出的SPR葡萄糖传感器灵敏度提高了6.1倍.
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600 μm直径光纤(HPCF-600/630-750-37)购于北京首量科技股份有限公司. GOD购于上海阿拉丁试剂, 疏基乙胺(MEA)购于上海麦克林生化科技有限公司, 乙酸钠(SA)缓冲溶液购于天津恒兴化学试剂制造有限公司, D-葡萄糖购于沈阳东兴试剂厂, 去离子水来自实验室水净化系统.
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所提出的反射式光纤SPR传感器用于测量葡萄糖浓度, 主要是通过传感器表面葡萄糖氧化酶与葡萄糖的特异性结合来使得光纤探头周围溶液的折射率发生变化, 从而使得光谱波长发生偏移. GOD可以使葡萄糖氧化成葡萄糖酸和过氧化氢. 其反应机理如下式所示:
$$ {{\rm{C}}_6}{{\rm{H}}_{12}}{{\rm{O}}_6} + {{\rm{O}}_2} + {{\rm{H}}_2}{\rm{O}} \stackrel{\rm{GOD}}{\longrightarrow} {{\rm{C}}_6}{{\rm{H}}_{12}}{{\rm{O}}_7} + {{\rm{H}}_2}{{\rm{O}}_2} $$ (1) 在此过程中, 葡萄糖、氧气和水在GOD催化作用下转化成葡萄糖酸和过氧化氢. 而GOD的催化作用是通过葡萄糖氧化酶中黄素腺嘌呤二核苷(FAD)辅基的氧化还原作用来实现的, 葡萄糖与FAD结合生成葡萄糖酸内脂, 然后葡萄糖酸内脂自发水解生成葡萄糖酸. 对于葡萄糖氧化酶来说, 辅酶为活性中心, 当葡萄糖氧化酶失去FAD辅酶, 意味着GOD失去活性[18]. 在测量过程中, 随着葡萄糖浓度的增加, 葡萄糖氧化酶中FAD辅酶的结合位点越来越少, 酶的活性越来越低, 导致探针周围溶液折射率变化小, 谐振波长偏移量变少, 最终趋于饱和状态. 这就是基于反射式光纤SPR传感器检测葡萄糖浓度的传感机理. 需要说明的是, 金膜的制备效果会影响光纤SPR传感器对溶液折射率变化的灵敏度S1, 而GOD敏感膜则决定了溶液折射率对葡萄糖浓度变化的灵敏度S2, 因此, 对于葡萄糖浓度测量来说, 最终的测量灵敏度S=S1×S2, 所以说, 金膜的制备效果和GOD的固定工艺均十分重要. 本文采用小型离子溅射仪(舜仪SAINT, JS-1600)将金膜镀在光纤表面, 再采用共价结合的方式将GOD固定在金膜表面, 光纤直径为600 μm, 金膜厚度约为40 nm, 传感区长度约为20 mm.
根据上述传感机理设计出整体的实验测量系统如图1所示, 实验系统由海洋光源(OCEAN OPTICS HL-2000, 波长范围360 nm-2000 nm), Y型分叉光纤(海洋光学, BIF600-VIS-NIR)以及海洋光谱仪(OCEAN OPTICS Maya 2000PRO)组成, 光从光源发出, 通过Y型光纤一端传输到葡萄糖溶液中的反射式光纤SPR传感器探头, 然后传感器探头将光反射后进入光谱仪进行解调, 最后通过光谱仪在电脑上得到输出光谱.
图 1 葡萄糖浓度检测系统结构图
Figure 1. Schematic of glucose concentration sensing system
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GOD与光纤的结合方法有多种, 如凝胶包覆、化学交联、共价键结合等方法, 其中共价键结合的方法更加稳定[8]. 但对于包覆金膜的传感器探头而言, 传统的共价键结合方法已不适用[19-20], 因此本文最终采用疏基乙胺与GOD共价结合的方法实现葡萄糖敏感膜的固定.
如图2所示, 固定GOD首先用乙醇和去离子水对探头进行清洁处理, 将光纤传感器探头放入乙醇溶液中浸泡10分钟, 随后再用去离子水清洗2-3次并放在空气中干燥. 将干燥后的传感器探头放入10 mM疏基乙胺(MEA)溶液中10小时, 疏基乙胺分子在金膜表面通过Au-S键结合从而形成游离的氨基[21], 氨基化完成后, 用去离子水清洗探头, 以去除非共价结合的疏基乙胺分子. 随后再将经过空气干燥后的探头放入用乙酸钠缓冲溶液配制的GOD溶液中浸泡, 通过GOD中的-COOH基团与光纤传感器探头表面形成游离的-NH2基团结合, 从而实现GOD与光纤的结合. 最后用去离子水清洗光纤传感器探头2-3次, 去除金膜表面未结合的GOD分子并在空气中干燥以备测试.
图 2 葡萄糖氧化酶GOD固定
Figure 2. Schematic diagram of GOD immobilization
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采用600 μm直径光纤制备反射式光纤传感器探头的流程如下: 用工具刀在光纤一端去除约2 cm的涂覆层, 然后使用打火机灼烧光纤裸露部分, 以便将涂覆层完全去除, 随后用擦镜纸和无水乙醇将光纤裸露部分擦拭干净并用研磨机将端面磨平, 最后用小型离子溅射仪镀制金膜, 调节时间参数和电流参数保持1分35秒和6 mA, 等待计时结束后反射式光纤传感器探头金膜制备完成.
配制不同折射率的氯化钠溶液(折射率范围(1.33 RIU - 1.38 RIU), 对该传感器进行折射率测量实验, 如图3所示, 随着溶液折射率的增加, 谐振波长发生红移, 谐振波长移动量为92 nm, 输出光谱有着较好的波形. 图4表明该传感器在测试折射率范围内对折射率的变化有良好的线性响应(R2=0.98396), 其中谐振波长
$ \lambda $ (nm)和折射率$ n $ (RIU)之间的关系可以表示为:
图 3 反射式光纤SPR传感器折射率测量图谱
Figure 3. Experimental spectra for refractive index measurement
图 4 灵敏度拟合曲线
Figure 4. Sensitivity curve for refractive index
$$ \lambda=2\;108.6 {n}-2\;197.9 $$ (2) 折射率测量实验结果表明: 反射式光纤SPR传感器对折射率的变化具有很高的灵敏度, 达到了2108.6 nm/RIU, 可以用于高灵敏度葡萄糖浓度的测量.
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在反射式光纤SPR传感器的基础上, 通过在金膜表面固定GOD来实现葡萄糖浓度的测量. 为了得到GOD与光纤传感表面结合的最佳参数, 从GOD结合时间和GOD的浓度对传感器输出波长最大偏移量的影响两个方面进行实验测试.
首先将3根氨基化后的传感器探头放入10 mg/mL的GOD溶液中, 分别浸泡2小时、5小时、10小时后取出, 进行葡萄糖浓度的测量实验. 结果表明: GOD结合2小时的最大波长偏移量明显低于结合5小时和10小时的, 但10小时和5小时相比, 最大波长偏移量的差别不大, 说明浸泡10小时后, GOD在金膜表面的结合量已经趋于饱和, 因此最终确定GOD的结合时间为10小时. 随后为了研究GOD浓度对传感器最大输出波长偏移量的影响, 将5根传感器探头分别浸入到5 mg/mL、10 mg/mL、15 mg/mL、20 mg/mL、25 mg/mL不同浓度的GOD溶液中浸泡10小时, 然后对制备的探头进行性能测试. 结果表明: 随着GOD浓度的增加, 最大波长偏移量先增加后减少, 产生该现象的原因可能是当GOD浓度过大时, 光纤表面的敏感膜厚度发生变化, 不利于传感器感知外界溶液的折射率变化, 从而减小了SPR共振光谱的波长漂移; 通过比较不同GOD浓度下传感器的波长漂移, 发现当GOD浓度为15 mg/mL时, 传感器的灵敏度和波长漂移均达到最大值, 因此最终确定GOD的最佳浓度为15 mg/mL.
将氨基化后的传感器探头放入15 mg/mL的GOD溶液中浸泡10小时后取出, 进行葡萄糖浓度的测量实验, 测量完一个葡萄糖浓度后, 在进行下一个葡萄糖浓度测量时, 都使用超纯水对光纤传感表面进行清洗, 以去除光纤传感表面未结合的葡萄糖分子. 在测量实验中发现, 每改变一次葡萄糖浓度, 光谱大约在90 s时逐渐趋于稳定, 待光谱稳定后进行下一浓度的测量. 测量结果如图5所示, 随着葡萄糖浓度的增加, 输出光谱红移, 在0-1.2 mg/mL范围内传感器的波长移动量为54.282 nm, 响应明显. 图6表示葡萄糖与SPR谐振波长之间的关系, 发现共振波长的偏移变化随着葡萄糖浓度的增加呈非线性的关系. 产生该现象的原因是: 在低浓度下由于葡萄糖分子与酶的结合位点比较充足, 结合速度快, 致使共振波长变化率比较大, 接近线性变化, 但随着浓度的继续增加, 由于酶的含量有限, 葡萄糖分子与酶的结合位点减少, 结合速度减慢, 共振偏移量逐渐减小, 最终呈饱和状态.
图 5 0-1.2 mg/mL葡萄糖浓度测量输出图谱
Figure 5. Experimental spectra for different concentration of glucose (0-1.2 mg/mL)
图 6 葡萄糖浓度测量灵敏度拟合曲线
Figure 6. Sensitivity curve for glucose concentration measurement
取其中0-0.5 mg/mL葡萄糖浓度下的测量数据进行拟合, 呈线性变化, 如图6所示, 灵敏度高达85.4 nm/(mg/mL), 线性度
$ R^2 $ =0.97782, 此时谐振波长$ \lambda $ (nm)和葡萄糖浓$ c $ (mg/mL)之间的关系可以表示为:$$ \lambda=85.4 c+637.4 $$ (3) 分辨率是指传感器所能分辨的最低可检测葡萄糖浓度, 在本文中, 传感器的分辨率可通过将光谱仪的波长分辨力(0.82 nm)除以传感器的灵敏度来计算. 由于折射率的测量灵敏度可达2108.6 nm/RIU, 葡萄糖的测量灵敏度可达85.4 nm/(mg/mL), 因此, 对于本文所提出的传感器, 折射率检测分辨率和葡萄糖检测分辨力分别是0.000389 RIU和0.0096 mg/mL.
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本文提出了一种反射式光纤SPR传感器, 并采用一种新型的共价结合方法将GOD固定在金膜表面, 实现了葡萄糖浓度的高灵敏度测量. 结果表明该传感器对折射率变化的灵敏度为2108.6 nm/RIU, 对葡萄糖浓度变化的灵敏度达到85.4 nm/(mg/mL), 而且反射式结构更适合于远距离测量.
Research on Glucose Concentration Sensor Based on Optical Fiber Surface Plasmon Resonance Technology
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摘要: 本文提出一种基于表面等离子体共振(surface plasmon resonance, SPR)的光纤传感器实现了葡萄糖浓度的测量. 该传感器探头采用反射式结构, 金膜镀在光纤表面激发SPR, 然后采用共价结合的方式将葡萄糖氧化酶(Glucose Oxidase, GOD)固定在金膜表面. 随着葡萄糖浓度的增加, 由于GOD和葡萄糖的结合使得探头表面折射率增加, 最终引起传感器谐振波长发生红移. 通过监测谐振波长的偏移量, 即可实现葡萄糖浓度的测量. 实验结果表明: 该传感器对折射率变化的灵敏度可达到2108.6 nm/RIU; 在0-0.5 mg/mL的葡萄糖浓度范围内, 谐振波长随葡萄糖浓度的增加而线性移动, 灵敏度为85.4 nm/(mg/mL); 随着葡萄糖浓度继续增加, GOD的结合位点逐渐减少, 导致光谱偏移量逐渐降低并趋于饱和, 在0.5-1.2 mg/mL的葡萄糖浓度范围内呈现非线性关系.Abstract: A fiber optic sensor based on surface plasmon resonance (SPR) was proposed to measure the glucose concentration. The sensing head adopted reflective structure, and gold film was coated on the fiber surface for exciting SPR. Then, glucose oxidase (GOD) was covalently bonded on the surface of the gold film. When the glucose concentration increased, the resonance wavelength had red shift due to the refractive index increase caused by the combination of the GOD and the glucose. Therefore, the glucose concentration could be obtained by monitoring the shift of the resonance wavelength. Experimental results showed that the sensitivity of the sensor to refractive index variation could be 2108.6 nm/RIU. The resonance wavelength would linearly change with the increase of glucose concentration in the concentration range of 0-0.5 mg/mL, and the sensitivity could be 85.4 nm/(mg/mL). With the further increase of glucose concentration, the binding site of the GOD gradually decrease, resulting in the saturation of resonance wavelength. Therefore, the relationship between the resonance wavelength and the glucose concentration in the range of 0.5-1.2 mg/mL was nonlinear.
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Key words:
- Fiber optic sensor /
- Surface plasmon resonance /
- GOD /
- Glucose concentration measurement
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七星彩规则
图 5 0-1.2 mg/mL葡萄糖浓度测量输出图谱
Fig. 5 Experimental spectra for different concentration of glucose (0-1.2 mg/mL)
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